大势所趋的多靶点CAR-T“热”在哪？又难在哪？来听周剑峰教授聊聊进展与展望！
立足当下，展望未来
第八届全国血液肿瘤学术大会已经落下帷幕，但是精彩话题仍在继续，今天小编和大家一起来回顾华中科技大学同济医学院附属同济医院的周剑峰教授以“多靶点CAR-T的进展和展望”为主题的大会演讲。
嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T）的发展历经25年，自2017CAR-T被批准进入临床使用，其适应证越来越广泛，CAR-T治疗选择也越来越多。
近年来，CAR-T在我国投入了临床使用，在淋巴瘤治疗领域属于2.5线药物，即二线挽救治疗后患者未达到完全缓解（complete response， CR）、部分缓解（partial response，PR）的患者可考虑行CAR-T治疗，因此它已经逐渐成为大家认可的治疗手段之一。但是目前CAR-T细胞疗法中仍有存在许多亟待解决的问题：
如何克服CAR-T双靶免疫逃逸？
★ CAR-T细胞治疗如何与移植相结合？
★ CAR-T能否克服高危遗传学异常的不良预后？——双打击淋巴瘤、TP53基因相关异常……
★ 如何进行合理的整体治疗模式探索？—CAR-T细胞治疗如何与靶向治疗、移植等相桥接？
★ 特殊部位淋巴瘤（如中枢、肠道）的CAR-T细胞治疗、CAR-T药物群体动力学变化有何差异？
二线挽救治疗后未达到CR、PR的患者无法从造血干细胞移植获益，其生存率很低，即便是使用CAR-T细胞治疗，疗效也只有35%左右，因此是否能将CAR-T细胞治疗和自体干细胞移植结合起来，成为目前重要的一个探索方向。
2020年美国血液学会年会（ASH）上，一项口头报告研究探索了自体移植和CAR-T细胞输注的协同方式，该研究入组了42例患者，中位随访时间为13.8个月。结果发现：32例（76.2%）患者二线治疗后达疾病稳定（stable disease， SD）和PR，经CAR-T治疗后CR率达81.0%，PR率达9.5%，优于目前任何一种治疗方式（图1）。
图1：自体移植和CAR-T细胞输注的协同方式ORR达90.5%
但目前而言单靶CAR-T仍然面临着较大的问题：
★ 肿瘤细胞的异质性会影响治疗效果；
★ 价格和治疗定位的矛盾使得其临床应用受阻；
★ 面临实际的临床问题，如靶向抗原治疗对靶点的影响、存在靶点丢失、反应下降等；
★ 面临同类治疗方法的竞争。
现有CAR-T治疗靶点逃逸的机制有哪些呢?
CD19靶点逃逸是复发的主要原因之一，复发的患者中88%是由于CD19靶点逃逸导致，可能的原因包括：
▆ 混合谱系白血病基因（Mixed Lineage Leukemia,MLL）重排B-ALL的CD-19髓系表型转化：治疗过程中转化为髓系白血病，CD-19靶点不表达。
▆ 治疗前CD-19剪切异构体与靶点逃逸有关：CD-19存在着很多的剪切异构体，其中CD-19的外显子2异构体不存在抗原结合部位，因此可能出现CD-19阳性，但是抗原抗体不能结合从而导致靶点逃逸。
▆ CD19失义突变是CD19阴性复发的主因：点突变导致构型异常使靶点不表达。
▆ 常见的胞质交换导致靶点逃逸：细胞和CAR-T之间会有一个胞啃的作用，实际上它的本质是一种胞质交换，肿瘤细胞异常转染，靶点被异位表达CAR遮掩，从而降低自身的CD19。采用双靶以及不同靶点CAR-T的共刺激信号合理组合可克服胞啃引起的靶点逃逸，从而提高疗效。
而CD22-CAR-T逃逸的主要原因是表达下调；B细胞成熟抗原（B Cell Maturation Antigen,BCMA） CAR-T治疗MM中也有靶点下调逃逸。
如何克服靶点逃逸？
双靶点可以克服逃逸现象，双靶点的概念最早是由2013年的一篇文献所提出的，双靶点可以覆盖90%以上的肿瘤群体，高于其他任意的治疗方式。双靶点覆盖实施的途径有以下几种（图2）：
图2：双靶点CAR-T的实现途径
第一种是采取序贯的输注，同时转染两个靶点（如CD19和CD22）到同一个细胞内，但是一个细胞同时转染不现实，因为质量控制十分非常困难，并且如果同一个细胞有很多拷贝的CAR-T的话，其安全性是值得担忧的。
第二种就是把两个抗原用串联或者并联的方式把它结合到一起，也是华中科技大学同济医学院附属同济医院目前所尝试的方法。该方法2016年的5月份正式注册，提供了最早的治疗难治/复发B细胞肿瘤的CAR-T细胞“鸡尾酒”疗法的临床证据。第一组病人入组到目前已经4年多了，有很好效果，并且患者大部分都没有做移植，但是相当一部分患者获得了无病生存。
华中科技大学同济医学院附属同济医院采用CD19和CD22做序贯输注，入组了2016年3月到2018年1月之间50名难治/复发B细胞肿瘤患者，中位随访时间14.0个月（0.4-27.4月），入组的患者都从中获益，包括细胞遗传学。尽管大部分患者没有衔接移植治疗，但是仍然有40%的长期生存率，其总生存（overall Suvival，OS）比现有的报道要明显的好很多，中位PFS9.9个月，预期中位OS18.0个月。
双靶点抗体在淋巴瘤中的临床数据如何？
▆ CD19/CD22 CAR-T序贯治疗有效
韩卫东教授团队入组了6例难治/复发B-ALL患者，将CD19和CD22联合进行输注，6例患者全部获得了MRD阴性完全缓解，回输后2周CAR-T拷贝数均达10^3以上，目前3例患者复发 （回输后10/5/3个月），但是实际上这个方法仍有一定缺陷，CAR-T消失（图3A绿色标记）是双靶治疗本身存在的挑战。
图3：韩卫东教授团队的双靶点研究
▆ 双靶治疗疗效持续
潘静教授团队在序贯输注的程序上做了一些改进，首先输注CD19，然后再输注CD22，甚至还试着尝试第三次输注。入组患者OR达100%，3例复发受试者中2例患者CD19抗原丢失，1例出现CD22下调，经大部分患者没有继续移植治疗，但是结果仍是治愈性的。
图4：双靶治疗疗效持续
▆ CD19/CD22 串联CAR-T在NHL中疗效显著:
韩卫东教授团队最近的研究入组了29例NHL患者，他们将CD19和CD20串联做了双靶进行输注，结果显示，患者PFS和缓解率均有显著获益。总的来说，双靶的优势在于全人源双靶可以反复使用、副作用小。
图5：CD19和CD20串联治疗NHL疗效显著
双靶在R/R MM 中的临床试验数据如何呢？
徐州医科大学徐开宁教授团队选取了2017年5月到2019年1月份之间22名难治/复发的多发性骨髓瘤患者，予以人源化CD19和鼠源化BCMA CAR-T共同输注，中位随访179天（72-295），反应率：达95%（20例），sCR：9例（43%），CR：3例（14%），VGPR：5例（24%）,SD:3例（14%），另外19例（90%）出现了CRS。（图6）
图6：CD19和BCMA CAR-T在MM中安全有效
▆BCMA/CD38 CAR-T安全有效
武汉协和团队入组了16例复发难治的MM患者，予以输注anti-BM38 CAR-T后sCR：8例（50%），VGPR：2例（12.5%），MRD阴性：14例（87.5%），10例（62.5%）出现了CRS（1-2级），4例（25%）出现CRS（≥3级）。
图7：BCMA/CD38 CAR-T安全有效
近年来，双靶点或多靶点治疗逐渐成为CAR-T治疗最大的热点。
双靶点CAR-T临床数据的小结：
B细胞相关肿瘤双靶点CAR-T临床安全性好；
部分临床研究中双靶点CAR-T疗效数据由于已报道单靶点CAR-T，但需要更多研究确认；
双靶点CAR-T治疗后有较低比例的靶点阴性复发。
双靶点产品开发的挑战
挑战1：靶点选择和验证
并非任意两个靶点可以随意组合成双靶点治疗的，需要参照临床依据考虑其合理性，譬如说CD19与BCMA的联用，选择CD19的理由尚不明确，最近nature communication杂志的一篇研究采用超显微数据发现BCMA上有CAR-T的存在，CAR-T CD19 可以清除CD19+ 多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）细胞（图8），为之提供了一些理论依据，但实验室结果与临床实际还相差甚远，需要更多的研究来探讨。
图8：CAR-T CD19 可以清除CD19+ MM细胞
此外急性髓系白血病中双靶点的合理选择：CD33/TIM3和CLL1/TIM3，既要考虑正常细胞，又要考虑搭配的合理性。最近的研究表明，CD33和TIM3、CLL1和TIM3可能是目前覆盖最广、对正常造血损伤最小的组合，但这也只是理论推测，还需要在实践中加以证明。
挑战2：CAR结构优化CD19/CD22
双靶点并不仅仅意味着将两个靶点放在一起，韩卫东教授的团队联合清华大学做了许多筛选和优化的程序，最后得到一个非常好的克隆，其动力学副作用、效益都非常好，体外数据结果也很好，因此双靶结构的优化十分关键，需要精益求精。
周教授总结到双靶点CAR-T开发仍面临的许多挑战：
· 双靶点的靶点选择和研究仍需要获得必要的数据支持临床开发，如表达谱分析、流行病学特征、疾病和靶点的时空变化；
· 双靶点CAR-T靶点结合部分仍需要进行结构优化，如轻重链的排列组合、linker的选择。
获得候选药物后，对非临药毒理研究设计、临床方案设计也需提出新的要求。
双靶点CAR-T产品开发的展望
众所周知，CD19和CD20结合是主靶点，在此基础上结合CD22后效果可观。多靶点的结合不仅仅是为了增强疗效，实际上理想的靶点很少，尤其是在实体瘤中，脱靶现象十分常见，三靶点可以克服CD19逃逸。
多靶点技术的实现，使不太好识别的靶点如CD33等的特异性增强。靶点数据的组合需要基于逻辑的顺序以及目前RNA测序的数据的分析进行合理的搭配，如CD70靶点比较广泛，因此增加一个靶点AXL或CDH6作为限制条件其特异性能大大的增强。
多靶点实现的基础是出现了单域抗体，该技术使多靶点技术出现了突飞猛进的发展。
最后周剑峰教授总结：
多靶点是CAR-T产品研发的必然趋势；
双靶点CAR-T已在临床上表现出较好的安全性和疗效；
双靶点CAR-T的开发适用于多种肿瘤；
多组学、合成生物学、抗体技术发展提供了强大的技术支持。
周剑峰教授
本文首发：医学界血液频道
本文作者：Salen
本文审核：周剑峰
责任编辑：Amelia
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